噬菌体平台技术，可为广大科研和企业用户更好的提供抗原表位筛选、药物靶点筛选、多种类型的抗体文库构建服务，为抗体药前期挖掘提供了方向。

　　很多人不知道，抗体药物研发，最关键的一步是。。。咨询，问对人很重要！！！

　　“我们的抗体药物专家经验比较丰富，曾经成功开发过上市治疗性抗体药物，可以针对具体需求来做个性化设计。AtaGenix将全程为您服务。”

　　目标：开发一种双特异性抗体药物，通过连接CD3抗体，增强针对某类特定肿瘤细胞A的免疫系统识别能力。

　　要开发双特异性抗体，我们得先分别获得抗单种抗原的鼠单抗---CD3抗体和肿瘤抗原A的抗体。接着进行双特异性抗体设计、表达及纯化，对正确组装后的双抗进行仔细的检测，最终实现大规模生产。

　　要求：得到的单克隆抗体可用于流式细胞术（FC）检测特定的人细胞膜蛋白。这些抗体将被用于人类细胞和小鼠的体外试验。

　　但是，我们向来不只做单一准备，永远备有为客户准备的Plan B。So，除了哺乳动物细胞表达系统，我们还选了大肠杆菌作为备用系统。两种表达方案一起进行，最终获得满足条件的抗原。

　　为了筛选到符合标准要求的抗体，我们将绿色荧光蛋白GFP与抗原蛋白在哺乳动物细胞中融合表达，通过FITC信号将表达GFP的细胞筛选出来，作为流式分析抗体特异性的阳性细胞；并使用能够识别GFP的一抗作为阳性抗体对照，来筛选特异性抗体。

　　流式检测中对抗原免疫原性最强的为3号小鼠血清，4号次之，我们决定对小鼠3号和4号进行融合。

　　将筛选出的两只小鼠脾细胞分别进行融合、亚克隆，FC检测保留最佳阳性抗体，最终获得最佳的30株抗肿瘤抗原A候选单克隆抗体杂交瘤细胞株。

　　a. 对3号小鼠细胞融合后的上清，进行ELISA检测，从中筛选出42株阳性细胞株（下表）。

　　b. 对3号小鼠细胞融合后的上清，进行FC检测，从中筛选出14株阳性细胞株（下表）。

　　每一步融合、亚克隆，都进行ELISA和FC检测，数据过多，一一罗列怕是要打我喽~努力总会有回报的！

　　经过多系统表达测试，我们成功地在哺乳动物细胞中重组表达了目标抗原，开发出对抗原拥有非常良好亲和力和特异性的单克隆抗体。最终，我们生产并纯化得到了30株抗肿瘤抗原A抗体的单克隆细胞株，产生的抗体均可以在流式细胞术中成功识别抗原。

　　做了8个嵌合抗体的表达纯化，将8个嵌合抗体和1个原始杂交瘤细胞纯化得到的抗体进行ELISA验证，用Biacore检测了这9个抗体的亲和力，筛选到了高亲和力的嵌合抗体。

　　表达了18个人源化抗体，将18个人源化抗体、原始杂交瘤细胞纯化得到的抗体及筛选得到的最佳嵌合抗体，进行ELISA验证，用Biacore检测了这20个抗体的亲和力，筛选得到高亲和力抗体。

　　将cDNA序列亚克隆到AtaGenix特有的哺乳动物细胞表达载体pTXs1中，本项目共使用21个表达质粒（下表）：

　　根据结果得出，CrossMAbs是表达的，但没有以完整的双特异性抗体结构组装，处于半形成状态。

　　结果显示，对于DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗体类型，正确地产生了完整的双特异性抗体结构。

　　值得一提的是，我们整个表达纯化过程对内毒素进行了有效的控制和去除，将内毒素控制在0.1EU/mg。

　　上面获得的DuoBodies类型重组抗体，目前只能特异识别单一抗体，如何将两种抗体组合连接，就需要神奇的Fab臂交换技术。

　　通过特定的条件，进行Fab臂交换重组抗肿瘤抗原A抗体和抗CD3抗体，形成双特异性抗体。

　　SEC-HPLC检测结果表明，No.7+No./10重组双特异性抗体浓度最高，是由两个重链和两个轻链组成的理想杂合四聚体。No.8+No./10重组抗体有一些降解或未组装完全，No.9+No./10重组抗体显著降解或组装较少。

　　ELISA滴定法同时测定双特异性抗体和以前获得的亲本抗体(AB1、AB2和AB3)对肿瘤抗原A和CD3的结合能力。

　　DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗体与肿瘤抗原A和CD3结合良好，说明这两类重组双特异性抗体构建正确。虽然CrossMAbs类型抗体也会结合，但它们的结合很可能是由半合成状态的抗体造成的。

　　项目的顺利推动，其中包含2000多封邮件沟通，30多个技术人员辛勤实验，历时4年，中法科学家通力合作。

　　目前，其中一个双特异性抗体已完成开发，生产并交付客户1.237g抗体。接下来，客户计划采用我们拥有自主知识产权的细胞株进行稳定细胞株构建。

　　所有的抗体药研发，都需要一个经得起折腾的平台。这样的平台应该是这样的：拥有经验比较丰富的抗体药物研发团队，首席科学家成功上市过治疗性抗体药物，成熟的抗体设计、表达、纯化技术，多元化的技术平台，为国内外科研院所及制药公司可以提供抗体药物研发服务。以杂交瘤测序为基础，经嵌合抗体表达验证到抗体的人源化设计改造，最终实现改造抗体的稳定细胞株构建和大规模抗体制备一站式服务。噬菌体平台技术，可为广大科研和企业用户更好的提供抗原表位筛选、药物靶点筛选、多种类型的抗体文库构建服务，为抗体药前期挖掘提供了方向。