PCR 缓冲液：按照说明书配制适当浓度的缓冲液，一般包含 TrisHCl（pH8.3 8.8）、KCl 等成分，为 Taq 酶提供适宜的反应环境。
2. 引物：上下游引物各加入 10 25 pmol，引物浓度过高有几率会使非特异性扩增增加。
4. PCR 缓冲液：加入 2.5 μL 10×PCR 缓冲液，提供反应所需的离子强度和 pH 环境。
退火：根据引物的 Tm 值设定退火温度，一般为 50 65℃ 退火 30 60 秒，引物与模板特异性结合。
延伸：72℃ 延伸 30 秒 1 分钟/kb（根据扩增片段长度调整延伸时间），Taq 酶从引物 3端开始合成新的 DNA 链。
循环次数：一般为 25 35 次循环，循环次数过多可能会导致非特异性产物增加及引物二聚体形成。
3. 终延伸：72℃ 延伸 5 10 分钟，确保 PCR 产物的完整性。
将配制好的反应体系轻轻混匀，短暂离心后放入 PCR 仪中，按照设置好的反应程序进行扩增。
制胶：配制适当浓度（一般为 1% 2%）的琼脂糖凝胶，加入适量的核酸染料（如 EB），倒入制胶模具中，插入梳子，待凝胶凝固。
观察：电泳结束后，在紫外灯下观察凝胶，根据 DNA 分子量标准判断扩增产物的大小及特异性。
2. 其他分析方法：还可通过测序、荧光定量 PCR、Southern 杂交等方法对 PCR 产物进行进一步分析。
1. 清洁无菌：整个 PCR 操作的流程应在清洁、无菌的环境中进行，防止外源核酸污染。实验台面应保持清洁，定期用 75%乙醇擦拭。
2. 专用设备：PCR 实验应使用专用的移液器、枪头、离心管等，避免交叉污染。
1. 低温保存：dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶等试剂应保存在 20℃或 80℃，避免反复冻融。
2. 避免污染：取用试剂时，应注意避开试剂瓶的瓶口接触其他物品，防止污染。使用后的试剂应及时放回冰箱保存。
3. 准确配制：配制试剂时，应严格按照说明书的要求做操作，确保试剂浓度准确。例如，MgCl₂溶液的浓度对 PCR 反应影响较大，应准确配制。
1. 质量要求：模板 DNA 应保证质量，避免存在降解或杂质污染。提取的模板 DNA 应进行纯度和浓度检测，A₂₆₀/A₂₈₀比值应在 1.8 2.0 之间，浓度应满足实验要求。
2. 避免抑制剂：模板 DNA 中应避免存在 PCR 反应抑制剂，如蛋白质、酚、氯仿等。如果模板 DNA 中含有抑制剂，可能会影响 PCR 反应的效率。
1. 合理设计：引物设计应根据模板序列进行，引物长度一般为 18 30 个碱基，引物的 GC 含量应在 40% 60%之间，避免引物内部形成二级结构及引物之间的互补配对。
2. 引物浓度：引物浓度过高有几率会使非特异性扩增增加，应根据实验优化引物浓度。同时，引物保存时应避免反复冻融，可将引物分装保存。
1. 定期校准：PCR 仪应定时进行校准，确保温度准确性和均一性。温度偏差可能会影响 PCR 反应的效率和特异性。
2. 正确放置样品：在 PCR 仪中放置样品时，应确保样品管放置均匀，避免因受热不均影响反应结果。同时，注意避开样品管盖子未盖紧导致样品蒸发或污染。
1. 优化体系：对于不同的模板和引物，在大多数情况下要对反应体系来优化，如调整 MgCl₂浓度、引物浓度、dNTPs 浓度等，以提高 PCR 反应的特异性和效率。
2. 摸索程序：根据实验情况，可适当调整退火温度、延伸时间、循环次数等反应程序参数，以获得最佳的扩增效果。例如，退火温度过高可能导致引物与模板结合不完全，过低则可能增加非特异性扩增。
1. 操作规范：在打开离心管、移液器吸头、PCR 管等时，应尽可能的避免剧烈振荡，防止形成气溶胶。加样时应缓慢操作，避免液体飞溅。
2. 通风处理：PCR 实验区域应保持良好的通风，及时排出可能会产生的气溶胶。实验结束后，应对实验台面进行清洁消毒，可使用紫外灯照射或消毒剂擦拭。
1. 防护措施：操作的流程中应佩戴手套、口罩等防护用品，避免接触 PCR 试剂和产物，防止核酸污染。
2. 废弃物处理：PCR 实验产生的废弃物，如废弃的 PCR 管、吸头、凝胶等，应按照生物安全要求做处理，一般都会采用高压灭菌后丢弃。
3. 溴化乙锭使用：若使用溴化乙锭（EB）进行核酸染色，应注意其致癌性。操作时应在通风橱中进行，避免皮肤接触和吸入，实验结束后应妥善处理含有 EB 的废弃物。
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